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臺達的EHPLC只有一個9針端口,怎么實現(xiàn)與在線電腦及觸摸屏同時連接？

如圖所示，EH自帶兩個通信口，一個是上面的插子，是COM2，RS485，一個是下面的圓口，是COM1，RS232，（這個是8針，不是9針），因此完全可以實現(xiàn)與電腦和觸摸屏同時通信。

另外還可以添加F485，F(xiàn)232擴展板，增加串口通信。

望采納。。。。。。

多糖的紫外光譜怎么看

經(jīng)過分級純化的多糖在測定結(jié)構(gòu)前須檢查其純度及測定分子量。

檢查純度最常用的判斷方法：

（1）用gc、hpLc測定組成多糖的單糖的摩爾比是否恒定。

用不同的柱型測定結(jié)果更為可靠。

（2）電泳只出現(xiàn)一條帶。

如可用聚丙烯酰胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳及玻璃纖維紙電泳。對于中性多糖可采用高壓電泳，以硼酸鹽為緩沖液，可增大其遷移速度。

（3）凝膠柱層析圖呈現(xiàn)對稱的單峰。若有“拖尾”現(xiàn)象，說明其均一性不夠好。陰離子交換層析純化

用DeAe一纖維素52(2.6x100cm)柱層析,0.lmol/Lnacl洗脫,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管檢測,繪制收集體積與糖含量之間的關(guān)系曲線?？词欠裼袉我粚ΨQ峰。

按照Ye等報道,采用DeAe一52一纖維素交換柱層析法(2.6x30cm)對鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖進行初步分離。DeAe一纖維素凝膠預(yù)處理:稱取DeAe一52一纖維素凝膠干粉,加入約10倍體積質(zhì)量比(ml/g)的0.5mol/Lna0h溶液浸泡30分鐘,倒出上清液,用大量去離子水反復(fù)浸洗至ph值近中性;再用相同體積的0.5mol/LhcI溶液浸泡30分鐘,倒出上清液,用大量去離子水反復(fù)浸洗至ph值近中性;最后用相同體積的0.5mol/lnaoh溶液再浸泡30分鐘,用大量去離子水反復(fù)浸洗至ph值中性。處理完畢后,進行濕法裝柱,用去離子水0.5mol/Lnacl溶液,去離子水依次分別平衡(流速1.0ml/min)2一3個柱體積備用.

糖樣100mg溶于5ml的去離子水中,離心除去不溶物,上樣于DeAe一52一纖維素陰離子

-1層析柱(2.6x30cm,cl型),分別采用去離子水0.1和0.3mol/LnacI溶液進行分段梯度洗脫,

流速1.0ml/min,自動收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數(shù)為橫坐標。吸光值(490nm)為縱坐標繪制DeAe一52一纖維素色譜柱洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型,合并相同組分,50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,對去離子水透析48h以去除nacI及小分子雜質(zhì),最后將透析內(nèi)液冷凍干燥,得初步純化產(chǎn)品。

初步純化多糖得率計算公式:

多糖得率(%)=純化多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量x100%

葡聚糖凝膠層析純化

采用sephadexg-100凝膠層析法對DeAe-52一纖維素初步純化的不同組分的多糖樣品進一步純化。葡聚糖凝膠(sephadexg一100)的預(yù)處理:稱取sephadexg一100凝膠干粉,加入30倍體積質(zhì)量比(ml/g)的去離子水,沸水浴5小時使其溶脹。冷卻后用去離子水反復(fù)浸洗,減壓脫氣后進行濕法裝柱,用0.1mna2so4;溶液平衡(流速0.25ml/min)2一3個柱體積備用。

分別稱取經(jīng)DeAe一纖維素一52初步純化的各多糖組分樣品20mg,溶于2ml0.1mna2so4溶液中,上樣于sephadexg一100層析柱(2.6x60cm)用0.1mna2so4溶液溶液洗脫,流速0.25ml/min,分步收集(5ml/管)。

用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數(shù)為橫坐標。吸光值(490nm)為縱坐標繪制sephadexg一100色譜柱洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型,合并相同組分,50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,對去離子水透析48h以去除na2so4;及小分子雜質(zhì),最后將透析內(nèi)液冷凍干燥,得不同純化產(chǎn)品。

純化多糖得率計算公式:

純化多糖得率(%)=純化多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量x100%

（鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖）

（4）紙層析法呈單一集中斑點。

取0.5%的多糖樣品溶液50ul,點樣于新華中速濾紙(3cmx20cm)距端點1cm處的中部,以正丁醇:濃氨水:水(4o:50:5)為展開劑,飽和2小時以上,在室溫下展開6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺藍液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一個清晰的斑點。

（5）瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳法

在瓊脂糖板(厚度為0.2cm)上點樣3一5ul采用濃度為0.075mol/L,ph8.6的巴比妥緩沖液,電泳1-1.5h,電壓為64一80V,甲苯胺藍(濃度為1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脫色。多糖純品經(jīng)電泳展開后,看是否呈現(xiàn)單一斑點,斑點是否清晰。

（6）紫外分光光度法

將多糖pwZ加0.9%nacI溶液溶解,配成濃度為1mg/ml的溶液,采用uV一16oA紫外可見光譜儀掃描(200nm一30onm)觀察260nm、280nm處是否有吸收峰。

多糖的分子量測定：

過去用超速離心沉降法、光散射法、滲透壓法、粘度法(:多糖質(zhì)譜鑒定)等，這些方法操作復(fù)雜且誤差較大，現(xiàn)已少用?，F(xiàn)在較常用的方法有凝膠過濾法和高效凝膠液相色譜法，這兩種方法須先用已知分子量的標準多糖對照測定樣品的分子量。

一般來說，多糖結(jié)構(gòu)分析包括以下幾點：

（1）單糖組成分析：研究確定單糖的種類及摩爾比；

完全酸水解后用高效液相色譜方法(hpLc)或氣相色譜方法測定。

（2）糖苷鍵類型：研究確定糖苷鍵及支鏈點連接位置；

甲基化分析方法

高碘酸氧化法與smith降解法

（3）糖環(huán)大?。貉芯看_定糖苷鍵為呋喃糖或吡喃糖；

紅外光譜

（4）異頭碳構(gòu)型：研究確定糖苷殘基的a-或p-構(gòu)型；

2DnmR.(TwodimensionalnuclearmagneticResonance)光譜分析方法測

（5）確定單糖殘基和重復(fù)單元的序列

甲基化分析方法與磁共振光譜分析方法結(jié)合分析，一般會參考多糖的單糖組成及摩爾比信息以利于解析多糖結(jié)構(gòu)。

高碘酸氧化法

薄層層析(TLc)——定性，

氣相色譜法

（6）取代基團位點：研究0h-修飾基團的種類和取代位點，如0-磷酸化，乙丑基取代，0-

硫酷化等；

比色分析方法

（7）多糖分子量分布的研究。

紫外光譜

定性與定量方法

薄層層析：殘基定性

氣相色譜：殘基定量

氣質(zhì)聯(lián)用：殘基定量

高效陰離子色譜法：殘基定量

鑒定結(jié)構(gòu)常用物理化學(xué)方法：

高效液相色譜:確定單糖組分和相對分子量

紅外光譜分析:測定多糖的官能團，不僅可以檢測酮糖、酵糖的恥喃糖環(huán)或呋喃糖環(huán)的構(gòu)象和糖苷鍵的構(gòu)型

核磁共振:α-構(gòu)型與β-構(gòu)型殘基的比例；判斷異頭碳構(gòu)型；推斷主鏈和支鏈連接鍵型鑒定結(jié)構(gòu)復(fù)合方法：

甲基化分析:推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例

高碘酸氧化法與smith降解法:判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數(shù)目

糖睛乙酸酷衍生物的氣相色譜法:單糖組成和摩爾比

各種多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定方法的具體實施方案

1、酸水解

（1）完全酸水解

-1稱取20mg樣品,加入2mL2mol·L的h2so4于安培管中沸水浴水解8h,水解液用

baco3中和至ph=7,離心,取上清夜置冰箱冷藏備測。（阿魏側(cè)耳子實體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）

（2）部分酸水解

稱取糖樣70mg，80℃條件下，0.05m三氟乙酸水解2h。降至室溫后，離心（4000r/min，10min），將沉淀干燥，留做gc分析。上清用無水乙醇除酸至中性(ph為6～7)，蒸餾水透析48h：將袋外透析液濃縮，真空干燥，留做gc分析；袋內(nèi)液濃縮至5ml左右，加10倍體積無水乙醇，醇沉過夜，離心(4000r/min，10min)，沉淀常規(guī)干燥，作gc分析；上清濃縮，真空干燥，留做gc分析。

2、高效液相色譜

確定樣品的單糖組成

色譜條件為:

色譜柱為shodexKs804sugar(300mm×7.8mm)

柱溫40度

流動相為水

-1流速0.8mL·min

檢測用410RⅠ示差檢測器，數(shù)據(jù)處理用810gpc軟件進行。

同時用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、巖藻糖8種單糖進

行對照,根據(jù)峰值確定樣品的單糖組成。

分子量的測定以標準分子量的葡聚糖pulluan作分子量測定標準。讓其通過高壓液相色譜柱,條件同上,先以分子量對數(shù)與對應(yīng)的保留時間作標準曲線,從標準葡聚糖pulluan的工作曲線上可以求得該成分分子量。

例如：（阿魏側(cè)耳子實體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）

將水解后的多糖樣品pw2進行hpLc分析,結(jié)果如表所示:阿魏側(cè)耳子實體多糖pw2經(jīng)過酸水解后,得到2種單糖:葡萄糖和半乳糖,摩爾比例1.77∶1。

例如：

4經(jīng)hpLc測定后對照標準曲線得多糖pw2的分子量為3.18×10。（阿魏側(cè)耳子實體多糖

分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）

4、甲基化分析

(1)基本原理

先將多糖中各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，然后將多糖中的糖苷鍵進行完全酸水解，水解后得到的化合物，其羥基所在的位置，即為原來單糖殘基的連接點。同時根據(jù)不同甲基化單糖的比例，可以推測出此種連接鍵型在多糖重復(fù)結(jié)構(gòu)中所占的比例。

用此種方法得到的羥基及nabh4還原醛基后產(chǎn)生的羥基，經(jīng)乙?；傻玫郊谆奶谴家宜狨?此產(chǎn)物易揮發(fā)，可進行g(shù)c分析)，再經(jīng)gc與gc-ms分析，通過氣相色譜的出峰順序和對質(zhì)譜譜圖的主要離子碎片的分析便可以較準確地確定糖的連接鍵型。

反應(yīng)通式如下

:

（2)甲基化反應(yīng)

取充分干燥的多糖樣品10mg，溶解在2.0ml的二甲基亞礬（Dmso)中。在n2保護下快速加入干燥的naoh粉50mg，用n2排出空氣，加蓋密封，室溫反應(yīng)1.0h并間歇振蕩。在n2保護下緩慢滴加碘甲烷1.0ml，用n2排出空氣，加蓋密封，室溫繼續(xù)反應(yīng)1.0h并間歇振蕩，反應(yīng)完成后加0.5ml水終止反應(yīng)。反應(yīng)液先用自來水流水透析48h，再用蒸餾水透析24h，透析液冷凍干燥得第一次甲基化樣品。第一次甲基化樣品繼續(xù)甲基化，反應(yīng)步驟同上，得第二次甲基化樣品。如此重復(fù)甲基化三次。甲基化后的樣品用紅外光譜檢測，3700

cm-1—3100cm-1，附近無羥基的特征吸收峰，表明甲基化反應(yīng)完全。

（3)甲基化樣品的衍生化

上述完全甲基化多糖樣品加入2mol/1的三氟乙酸(TFA)3.0ml,120℃密閉水解2.0h。冷卻后50℃減壓蒸發(fā)干，加2.0ml甲醇再蒸發(fā)干，重復(fù)三次，最后蒸發(fā)干得完全甲基化多糖的水解產(chǎn)物。加蒸餾水2.0ml使其溶解，再加硼氫化鈉25mg，振蕩后室溫還原反應(yīng)2.0h。反應(yīng)完后滴加0.1mol/1醋酸分解過量的硼氫化鈉并調(diào)ph值至5.5~7.0弱酸性。反應(yīng)液50℃減壓蒸發(fā)蒸干，加2.0ml甲醇再蒸干，重復(fù)三次，最后蒸發(fā)干。

上述蒸發(fā)干樣品加入1.0ml醋酸酐和1.0ml吡啶，封管后在沸水浴中反應(yīng)1.0h。反應(yīng)液50℃減壓蒸發(fā)干，加2.0ml甲醇再蒸發(fā)干，重復(fù)三次，最后蒸發(fā)干。加入丙酮1.0ml，用0.45ul尼龍微孔濾膜過濾，取樣進行g(shù)c/ms分析。

(4)衍生化樣品的gc/ms分析

多糖樣品經(jīng)甲基化、水解、還原、乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯，進行g(shù)c/ms聯(lián)機分析，根據(jù)文獻的相對保留時間和不同單糖的主要離子碎片(m/e），推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例。

本實驗采用的條件為:gc(Variancp3800型)和ms（Variansatum2200型)氣相一質(zhì)譜聯(lián)用儀，Db-5ms石英毛細管柱(30mx0.25mmx0.25um);程序升溫，初溫80℃，保持1min，以8℃/min升至210℃，保持1min，再以20℃/min升至260℃,保持1min;氦氣作載氣，進樣口溫度250℃，分流比1:50，柱流速1.0ml/min;電子電離源(eI源)70eV，倍增器電壓350V，燈絲電流250uA，接口溫度260℃,離子源溫度180℃，質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍30~450，掃描速率2.5scan/sec。（胞式層孔菌菌絲體多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性研究）

流程圖如下：（mAep-2a-2b是安絡(luò)小皮傘菌絲體多糖的某個過程中第某個樣品）

篇二：1多糖含量檢測

億信檢測推出單糖組成方案

簡介：gc-ms（氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定單糖組成）

1多糖含量檢測

方法：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生

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桿狀病毒-昆蟲細胞蛋白表達服務(wù)案例—鐘鼎生物

一、實驗設(shè)計?

按照客戶的預(yù)期，期望通過桿狀病毒-昆蟲細胞蛋白表達系統(tǒng)以胞外分泌的形式獲得目的蛋白，因此我們分析客戶提供的Target-Gene序列，整個蛋白序列呈親水性，自身不帶信號肽序列，并且序列本身含有昆蟲細胞的稀有密碼子，因此我們設(shè)計思路為：

1.1、以客戶的基因序列翻譯的蛋白序列為源模板，通過密碼子優(yōu)化一套最適宜SF9細胞系的基因序列。

1.2、在蛋白序列N端添加GP67信號序列幫助蛋白穿膜分泌表達至胞外，在C端添加6XHis-Tag便于重組蛋白的檢測和親和純化。

依據(jù)上述設(shè)計思路，以基因合成的方式構(gòu)建pFast-bac1-target-gene表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后通過藍白篩選方法獲得重組的Bacmid，經(jīng)PCR鑒定之后轉(zhuǎn)染sf9細胞，以獲得P1代病毒和P2代病毒。侵染200ml小試表達，通過western blot檢測蛋白表達情況，確認蛋白表達情況，再通過Ni-resin親和純化獲得80%以上目的蛋白。

二、試劑和耗材

轉(zhuǎn)染試劑（購自invitrogen公司）；培養(yǎng)基（購自HYclone公司）；抽提試劑盒（購自Axygen公司）；PCR試劑盒（IO-RAD公司)；血清（購自invitrogen公司）；六孔板（購自corning公司）；細胞培養(yǎng)瓶（購自corning公司）；離心管（購自corning公司）；PCR反應(yīng)管(購自Fisher公司)；Agarose(購自上?；蚬?；DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(購自AXYGEN公司)；低熔點瓊脂糖（購自sigma公司）；中性紅（購自碧云天生物公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

三、主要實驗儀器

Allegra 21R 臺式高速冷凍離心機 (美國BECKMAN公司)，臺式高速離心機(德國SORVAL公司)，Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean II垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，PTC-200基因擴增儀(美國MJ Research公司)

320-S pH計(美國Mettler Toledo公司)，AR5120電子天平(美國AHOM S公司)，MultiTemp III 恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀(美國Amersham Pharmacia公司)，雪花狀制冰機(日本SANYO公司)，JY92-2D超聲波細胞粉碎機(中國新芝科器研究所)，蛋白核酸檢測儀（南京大學(xué)普陽科學(xué)儀器廠），超凈工作臺(中國蘇凈集團)，NANODROP2000（美國Thermo公司）

四、蛋白性質(zhì)分析

4.1 客戶提供原始基因序列

GTGGGGTGCT******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客戶研究內(nèi)容，不予顯示----NNNNNNNNNNNNNNN*******CTTCTCCCTT

4.2 編碼的蛋白序列如下（理論分子量41.18KD，理論等電點PI6.73）

GCSVDFSK******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客戶研究內(nèi)容，不予顯示----NNNNNNNNNNNNNNN*******TAGSTDHMDHFSL

4.3 稀有密碼子序列分析如下圖所示（紅色：使用頻率低于10% 灰色：使用頻率低于20%，綠色為正常頻率密碼子）

4.4 蛋白序列跨膜及親疏水性分析

4.5 信號肽預(yù)測

綜上所述：

1、蛋白理論分子量為 41KD，屬于正常分子量范圍，較適宜表達。

2、通過對基因密碼子使用頻率的分析，如果以293細胞為表達宿主，基因序列上使用頻率低于20%的密碼子X個，使用頻率低于10%的密碼子X個，優(yōu)化后通過基因合成方式獲得目的基因。

3、通過對蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和親疏水性分析，蛋白整體呈親水性，但從473AA之后，蛋白存在典型的跨膜結(jié)構(gòu)，建議去除后表達以提高成功率。

4、目的蛋白自身無信號肽，添加GP67信號肽便于蛋白分泌表達。為了純化方便，考慮在C端添加His標簽。

五、實驗方法及實驗結(jié)果

5.1 pFast-bac1-target-gene表達質(zhì)粒構(gòu)建

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因，雙酶切連接至pFast-bac1載體的BamH I和Hind III之間；將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入TOP10克隆菌株，挑取陽性克隆子測序，測序結(jié)果拼接如下所示，單劃線區(qū)為目的基因基因區(qū)域。紫色區(qū)域為酶切位點，黃色區(qū)域為GP67信號肽，綠色區(qū)域為6XHis標簽；

g c c a c c A T G T T A C T C G T C A A C C A G A G C C A C C A A G G G T T T A A C A A G G A A C A C A C A T C C A A A A T G G T T T C A G C T A T C G T G CT T T A T G T T C T T C T T G C C G C G G C A G C T C A T T C T G C A T T C G C G A G A T T G G C T T G T A A G G A A G A T T A C A G A T A T G C C * * * * * * N N N N N N N ---略--- N N N N N N N * * * * * A T C A T C A C C A T C A C C A T C A C T A A a a g c t t

5.2 使用Chromas軟件查看測序峰圖文件，截取部分序列示例如下：

5.3 pFast-bac1-XXX質(zhì)粒酶切圖與載體構(gòu)建示意圖如下所示：

5.4 重組桿狀病毒表達載體（Bacmid，桿粒）的構(gòu)建

5.4.1 桿粒菌株轉(zhuǎn)化

DH10Bac E.coli 感受態(tài)細胞冰上解凍；(2)將200ng的pFastBac1-gene轉(zhuǎn)移載體緩慢加入感受態(tài)細胞中，輕輕混勻；(3)冰上放置30min，然后42℃熱擊90s；(4)迅速冰上靜止5min； (5)向EP管里加入900 μl S.O.C.培養(yǎng)基；(6)37℃，225 rpm震蕩搖菌4h；(7)取100μl菌液涂于含有50 mg/ml 卡那霉素，7 mg/ml 慶大霉素，10 mg/ml 四環(huán)素，100 mg/ml x-gal,and 40 mg/ml IPTG的LB平板；(8)37℃，倒置培養(yǎng)48h。

5.4.2 重組Bacmid質(zhì)粒的鑒定

挑取3個白色單克隆菌落接種分別接種于5ml含有50 mg/ml卡那霉素，7 mg/ml 慶大霉素，10 mg/ml 四環(huán)素，搖菌，菌液PCR初步篩選陽性克隆菌。小量抽取質(zhì)粒，PCR驗證桿粒正確性，因桿粒大小135Kb，酶切方式很難進行驗證，故采用PCR進行驗證，理論上，若目的基因成功轉(zhuǎn)座至Bacmid中，那擴增產(chǎn)物的大小應(yīng)為（2300bp+目的基因長度）

5.5轉(zhuǎn)染及收獲病毒

5.5.1 sf9細胞的培養(yǎng)

sf9細胞培養(yǎng)使用SF 900Ⅱ培養(yǎng)基培養(yǎng)，一般每3天分瓶傳代一次。處于對數(shù)生長期細胞且細胞活力大于95%的sf9 細胞用于轉(zhuǎn)染實驗。

5.5.2 Sf9細胞凍存方法：

細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，活力超過90%; 計數(shù)，使得儲存濃度為1×107 /ml至2×107 /ml; 準備所需量的儲存培養(yǎng)液，加DMSO至10%和FBS至30%，預(yù)冷培養(yǎng)液保存于4℃; 離心懸浮細胞或單層細胞 100×g，5min，用預(yù)冷的凍存液懸浮至所需密度; 混勻，分裝至凍存管; 將凍存管放入填有脫脂棉的泡沫盒，-80℃放置1天；移入液氮罐中保存。

5.5.3 Bacmid轉(zhuǎn)染sf9細胞

(1)在六孔板中接種9×105個細胞/2ml/孔。其中培養(yǎng)基Grace’s medium中含有青霉素50U/ml，鏈霉素50ug/ml，10％FBS；

(2) 27℃培養(yǎng)1h，使細胞貼壁;?

(3) 在這期間制備Bacmid與Cellfectin Reagent復(fù)合物：

A. 用100ul不完全Grace’s medium（不含雙抗、FBS）稀釋1ug Bacmid（約5ul）;?

B. 在使用前將Cellfectin Reagent倒置5~10次，使其充分混勻，取6ul Cellfectin Reagent用100ul不完全Grace’s medium（不含雙抗、FBS）稀釋;?

C. 將上述兩種稀釋液合并（總體積約210ul），輕輕混勻，室溫孵育15~45min;?

(4) 在制備Bacmid與Cellfectin Reagent復(fù)合物期間，將六孔板中的培養(yǎng)基吸掉，用2ml不完全Grace’s medium（不含雙抗、FBS）洗滌一次，去掉培養(yǎng)基;?

(5) 在含有210ul的復(fù)合物的管內(nèi)加入800ul的不完全Graces medium（不含雙抗、FBS），輕輕混勻，加到每個孔中;?

(6) 將六孔板內(nèi)的細胞孵育5h，27℃；

(7) 去掉復(fù)合物混合液，然后在每個孔中加2ml完全培養(yǎng)基（SF900含雙抗、10％FBS）；

(8) 在27℃濕度培養(yǎng)箱中孵育72h或著直到細胞出現(xiàn)病毒感染跡象。上清和沉淀需要分別制備樣品，待后期western blot表達鑒定使用。

5.5.4 P1病毒液的收集

當(dāng)細胞出現(xiàn)感染跡象時，將細胞上清轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min以去除細胞及大的碎片，可用蛋白結(jié)合率低的0.2um的濾膜過濾，滴度損失小于10%；將含病毒的上清液轉(zhuǎn)移到另一個無菌帶蓋的EP管中（一般，P1的滴度在10^6pfu/ml左右）, 將得到的病毒液體避光置于4℃冰箱（短期）。若長期保存，進行1ml分裝，避光儲存于-80℃。

5.5.5 P2病毒擴增及收獲

原代病毒滴度(P1)較低，介于1×106~1×107，擴增后滴度為1×107~1×108。 50ml搖瓶中加入適量的P1病毒。擴增病毒時可用下列公式進行計算：

MOI(Multiplicity of infection)在0.01~0.1之間,?

接種量 （ml）:desired MOI (phf/ml) ×(total number of cells) tlter of viral inoculum (puf/ml)?

感染細胞48 h收集的病毒擴增的將近100倍，超過48h 收集的病毒質(zhì)量較低。每種病毒的收集時間都有一定的差別，如在72h收集，但是隨著細胞的裂解，病毒的增殖活力會受損。

5.5.6 病毒滴度檢測

六孔板中細胞120萬/孔，靜置培養(yǎng)1h，病毒梯度稀釋101 102 103 104 105 106 107 108 ，去掉六孔板中的上清，取106、107、108三個滴度病毒加入到六孔板中，平行對照2組，孵育1h，配置空斑培養(yǎng)基，每孔加入2mL空斑培養(yǎng)基；第四天加入中性紅染色液；7-10天計數(shù)空斑數(shù)，算病毒滴度。

5.6 重組蛋白表達純化

f9細胞以2×106/ml瓶接種于500ml細胞培養(yǎng)瓶中；待細胞生長至對數(shù)期，接P2代病毒感染sf9細胞；48~72h內(nèi)收集細胞及上清，用于重組蛋白表達的檢測。

1、依此條件方法放大培養(yǎng)。4℃ 10000g離心20 min，取上清；

2. 利用低壓層析系統(tǒng)，上清液以0.5 ml/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B親和層析柱；

3. 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達基線；?

4. 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達基線；

5. 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；

6.將上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS（PH7.4）進行透析過夜；

7. 進行10% SDS-PAGE分析。

5.7 Western Blot檢測

1. 樣品上樣0.01ug。

2. 上樣完畢后，聚丙烯酰胺凝膠先90V跑完積層膠，再將電壓升至200V直到電泳結(jié)束。

3. 電泳結(jié)束后，取下凝膠進行轉(zhuǎn)膜，恒壓100V轉(zhuǎn)膜，約為1.5小時。

4. 電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取下膜后先用PBS洗滌4次，每次5分鐘。然后置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉37℃ 1小時。

5. 用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中37℃反應(yīng)1小時。

6. 洗膜4次，每次5 分鐘；用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗。膜在二抗中37℃反應(yīng)1小時。

7. 洗膜ECL顯影。

六. 實驗結(jié)果及分析

6.1 質(zhì)粒鑒定結(jié)果

6.1.1 質(zhì)粒濃度

6.1.2 PCR鑒定結(jié)果

說明：

目的基因2600bp，使用pUC/M13引物擴增產(chǎn)物理論大小為4900bp，實驗結(jié)果與預(yù)期一致。

6.2 P2代病毒蛋白表達鑒定

6.3 病毒滴度檢測，采用病毒空斑實驗方法檢測病毒滴度

說明：

P2代病毒感染sf9細胞，通過檢測細胞上清和細胞裂解液發(fā)現(xiàn)：目的蛋白大部分存在上清中，正常分泌至胞外。

說明：

通過6孔板病毒空斑實驗法檢測病毒低毒，可以確認我們提供的病毒低毒達到107pfu/ml。

6.4 通過Ni-IDA-Resin親和純化目的蛋白，獲得純度約85%的目的蛋白

說明：

通過Ni-IDA-resin收集目的蛋白，經(jīng)過濃縮處理后使用SDS-PAGE檢測，得到了85%以上的目的蛋白。

說明：

通過SEC-HPLC進一步純化，獲得單一峰的目的重組蛋白，HPLC檢測純度在95%以上。

七. 發(fā)貨清單

序號類型名稱規(guī)格常數(shù)

1克隆質(zhì)粒PMD18-target gene2-4ug2

2克隆菌株P(guān)MD18-target gene in DH5 α1ml1

3表達菌株P(guān)Fast-Bac1-target2-4ug2

4桿粒bacmidBacmid-target in TOP101ml1

5P2代病毒MT 107pfu/ml1ml5

6重組蛋白MT protein 純度85%，濃度 0.5mg/ml1ml3

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HPLC的常用術(shù)語解釋

高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。它是在生化和分析化學(xué)中常用的柱層析儀。接下來我為大家整理了HPLC的常用術(shù)語解釋，希望對你有幫助哦!

第一部分　色譜曲線

1、色譜圖(chromatogram)：色譜柱流出物通過檢測器系統(tǒng)時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間或流動相流出體積的曲線圖，或者通過適當(dāng)?shù)? 方法 觀察到的紙色譜或薄層色譜斑點、譜帶的分布圖。

2、(色譜)峰(chromatographic peak)：色譜柱流出

3、峰底(peak base)：峰的起點與終點之間的連接的直線

4、峰高(h ，peak height)：色譜峰最大值點到峰底的距離(圖1 中的BE)。

5、峰寬(W ，peak width)：在峰兩側(cè)拐點(圖1 中的F ，G)處所作切線與峰底相交兩點的距離

6、半高峰寬(W h/2 ，peak withd at half height)：通過峰高的中點作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點之間的距離(圖1 中的HJ)。

7、峰面積(A ，peak area)：峰與峰底之間的面積

8、拖尾峰(tailing peak)：后沿較前沿平緩的不對稱的峰。

9、前伸峰(leading peak)：前沿較后沿平緩的不對稱的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)

10、假峰(ghost peak)：除組分正常產(chǎn)生的色譜峰外，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現(xiàn)的色譜峰，即并非由試樣所產(chǎn)生的峰。這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性、定量帶來誤差。(又叫鬼峰)

11、畸峰(distrorted peak)：形狀不對稱的色譜峰， 前伸峰、拖尾峰都屬于這類。

12、反峰(negative peak)：也稱倒峰、負峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。

13、原點(origin)：紙或薄層板上滴加試樣部位的中心點

14、斑點(spot)：平面色譜法中，組分在展開和顯譜后呈現(xiàn)近似圓形或橢圓形的色區(qū)

15、區(qū)帶(zone)：在色譜柱、紙或薄層板上被分離組分所占的區(qū)域。

16、復(fù)斑(multiple spot)：一種組分展開后形成兩個或多個清晰斑點。

17、區(qū)帶拖尾(zone tailing)：由于物理、化學(xué)等作用的影響，一種組分在展開后形成的彗星形狀斑點。

18、基線(base line)：在正常操作條件下，僅有流動相通過檢測器系統(tǒng)時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號曲線。

19、基線漂移(baseline drift)：基線隨時間定向的緩慢變化。

20、基線噪聲(N　，baseline noise)：由于各種原因而引起的基線波動。

21、統(tǒng)計矩(moment)：色譜流出曲線是組分在檢測器中濃度或質(zhì)量依時間的統(tǒng)計分布曲線，響應(yīng)值對應(yīng)于分布密度。組分在柱內(nèi)遷移時間　r　次冪的數(shù)學(xué)期望稱為流出曲線的　r　階原點矩。而組分在柱內(nèi)遷移時間與平均遷移時間差的　r　次冪的數(shù)學(xué)期望稱為流出曲線的　r　階中點矩。

22、一階原點矩(first origin moment)：組分在柱內(nèi)遷移時間的數(shù)學(xué)期望。當(dāng)流出曲線為對稱峰時，即為組分的保留時間。

23、二階中心矩( μ2 ，second central moment)：二階中心矩為流出曲線的方差。定義為：μ2=E(t-Et)2 式中，E代表平均。

24、三階中心矩(μ3 ，third central moment)：定義為：μ3=E(t-Et)3

可以表示流出曲線的不對稱程度。峰形對稱時μ3=0，前伸峰μ30　，拖尾峰μ30.

第二部分　分離模式

1、液相色譜法(liquid chromatography ，LC)：用液體作流動相的色譜法。

2、液液色譜法(liquid liquid chromatography，LLC )：將固定液涂漬在載體上作為固定相的液相色譜法。

3、液固色譜法(liquid solid chromatography，LSC )：用固體(一般指吸附劑)作為流動相的液相色譜法。

4、正相液相色譜法(normal phase liquid chromatography ，NPLC)：固定相的極性較流動相的極性強的液相色譜法。

5、反相液相色譜法(reversed phase liquid chromatography，RPLC )：固定相的極性較流動相的極性弱的液相色譜法。

6、柱液相色譜法(liquid column chromatography )：在柱管內(nèi)進行組分分離的液相色譜法。

7、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC )：具有高分離效能的柱液相色譜法。

8、尺寸排除色譜法(size exclusion chromatography，SEC )：用化學(xué)惰性的多孔性物質(zhì)作為固定相，試樣組分按分子體積(嚴格來講是流體力學(xué)體積)進行分離的液相色譜法。

9、凝膠過濾色譜法：(gel filtration chromatography )：水或水溶液作為流動相的體積排除色譜法。

10、凝膠滲透色譜法：(gel permeation chromatography ，GPC)：有機溶劑作為流動相的體積排除色譜法。

11、親和色譜法(affinity chromatography )：用連接在基體上的配位體做固定相，使其與蛋白質(zhì)或其他大分子發(fā)生可逆的高選擇性的相互作用，利用不同親和力進行分離的液相色譜法。

12、離子交換色譜法(ion exchange chromatography ，IEC)：以離子交換作用分離離子型化合物的液相色譜法。

13、離子色譜法(ion chromatography )：以含有某種特定離子的水溶液作為流動相，流出液通過抑制柱(或不通過抑制柱)，在降低流動相背景信號的條件下用于分離離子的液相色譜法。

14、離子抑制色譜法(ion suppression chromatography )：通過調(diào)節(jié)流動相的PH值來抑制試樣組分的電離，以分離離子型化合物的液相色譜法。

15、離子對色譜法(ion pair chromatography )：用形成離子對化合物進行分離的液相色譜法。16、疏水作用色譜法(hydrophobic interation chromatography )：用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為流動相，借疏水作用分離生物大分子化合物的液相色譜法。

17、制備液相色譜法(preparative liquid chromatography)：用能處理較大量試樣的色譜系統(tǒng)，進行分離、切割和收集組分，以提純化合物的液相色譜法。

18、平面色譜法(planar chronatography)：在平面介質(zhì)上進行組分分離的色譜法，也叫平板色譜法。

第三部分 ?常用術(shù)語

M：分子量

MC：二氯甲烷(methylene chloride)

MeOH：甲醇(methanol)

MS：質(zhì)譜

h：峰高

HPLC：高效液相色譜

ID：內(nèi)徑，dC

A：吸收度(式3.1，3.2);也作面積

ACN：乙腈(acetonitrile)

B(%B)：二元流動相中的強溶劑(% v/v)

C8，C18：烷基鍵合相的鍵長度(八烷基或十八烷基)

CD：環(huán)糊精(cyclodextrin)

CV：變異系數(shù)(通常以%表示);式15.3

dC：色譜柱內(nèi)徑(cm)

dP：顆粒直徑(μm)

DAD：二極管陣列檢測器

EC：電化學(xué)(檢測器)

F：流速(ml/min)

FL：熒光(檢測器)

GS：梯度斜度參數(shù)(式8.2a);k*=20/GS

IEC：離子交換色譜(ion-exchange chromatography)

IPC：離子對色譜 (ion-paire chromatography)

k：保留因子(式2.4)

k*：梯度洗脫中，k的有效值或平均值(式8.1)

ka，kZ：色譜圖中，首峰(a)和末峰(z)的k值

L：色譜柱長度(cm)

LC-MS：液相色譜-質(zhì)譜

MTBE：甲基-叔-丁醚(methyl-t-butyl ether)

N：色譜柱塔板數(shù)(式2.82.8b)

N：噪音(式3.3，圖3.3)

NARP：非水反相HPLC

NPC：正相色譜

P：色譜柱壓力降(通常以psi表示)(式2.9)

pKa：酸或供質(zhì)子堿的酸性常數(shù)

PAH：多環(huán)芳烴(polyaromatic hydrocarbon)

RS：分離度(式2.1)

RI：折光指數(shù)

RPC：反相色譜

S：信號;式3.3;圖3.3;以及由式6.1定義的參數(shù)

tD：延遲或滯留時間(min，用于梯度洗脫中);等于VD/F

tG：梯度時間(min)

tR：保留時間(min)(圖2.2);等于tO(1+k)

tRa，tRz：色譜圖中首峰(a)與末峰(z)的保留時間，tR(min)(圖8.6a)

tO：色譜柱死時間(min)(式2.5)

t1，t2：相鄰譜峰1與譜峰2的保留時間(min)

TEA：三乙胺(triethylamine)

THF：四氫呋喃(tetrahydrofuran)

UV：紫外光譜

VD：延遲或滯留體積(mL);為梯度混合器與色譜柱人口之間的體積(包括混合器的體積)

Vm：色譜柱死體積(mL)(式2.6);Vm為色譜柱內(nèi)部的流動相體積，不包括附于固定相上的溶劑

Vmax：最大樣品體積(mL)(式13.1)

Va：樣品體積(mL)

w：重量(mg);也作半峰高處的峰寬(min)

wmax：不超載色譜柱的最大進樣量(mg)(式2.17)

wS：色譜柱的飽和容量(mg)(式13.4)

W：峰底寬(min)(圖2.2)

Wth：大進樣量對峰底寬的貢獻(min)(式13.2)

WO：小進樣量的峰底寬(min)

W1/2：半峰高處的峰寬(min)(圖1.1)

a：分離因子，等于k2/k1，其中k2與k1分別為相鄰譜峰2和譜峰1的k值

△tR：tRz-tR(min)

△%B：梯度洗脫期間，%B的變化

ε：摩爾吸收系數(shù)

εo：正相HPLC 中溶劑或溶劑混合液的強度

η：粘度(CP)

不常有符號

A，B，C：式2.11中的常數(shù);數(shù)值A(chǔ)，B與C隨k值而變化，但改變 其它 條件或溶質(zhì)時基本不變

A，B，C：式2.10中的常數(shù);數(shù)值A(chǔ)，B與C隨條件和樣品而變化

A，B，C：式2.10a中的常數(shù);數(shù)值A(chǔ)，B與C隨條件和樣品而變化

C：譜峰最大值處的濃度(mol/L)

CO：注入樣品中溶質(zhì)的濃度(mol/L)

GI：化學(xué)電離(MS)

DGA：N，N-二甲基-1-萘酰胺;(也作二甲基苯胺dimethylaniline)

EI：電子電離(MS)

ELS：蒸發(fā)光散 射擊 (Evaporative light scattering)

EtOAc：乙酸乙酯(ethyl acetate)

FAB：快速原子轟擊(MS)

FD：場解吸附(MS)

h：折合板高，等于H/dP(式2.11)

HB：羥基苯甲酸(hydrxybenzoic acid)(圖7.8，7.17與7.19)

HFBA：七氟丁酸(hyptafluorobutyric acid)

IPA：異丙醇(isopropanol)

kW：以水作為流動相的k值(式6.1)

LCEC：液相色譜電化學(xué)檢測器

LD：激光解吸(MS)

LSIMS：液態(tài)二級離子質(zhì)譜

MALDI：基質(zhì)輔助激光解吸電離

MP：對羥苯甲酸甲酯

[P-]m：流動相中離子對試劑P-的濃度(mmol/L)

PAD：脈沖電流分析檢測器

PBP：極性鍵合相

PD：等離子解吸(MS)

PP：對羥苯甲酸丙酯

PTH：乙內(nèi)酰苯硫脲

R+，R-：分別為陰離子與陽離子離子交換色譜柱中的荷電功能基困(式7.4和7.5[如-N(CH3)3+和-SO3-]

RF：響應(yīng)因子

TBA+：四丁基銨離子

tBME：見MTBE

TMS：三甲基硅烷(trimethylsilyl;也為C1)

TNB：1，3，5-三硝基苯(1，3，5-trinitrobenzene)

TOF MS：時間飛行質(zhì)譜

TSP：熱噴霧(MS)

u：流動相通過色譜柱的速度(cm/s);等于L/to

V：峰底寬(mL)

Vc：色譜柱內(nèi)峰展寬對V的貢獻;也作小樣品量峰底寬(mL)(式2.16)

VR：保留體積(mL)

W：峰寬(min)(式2.12)

Wc，WS，：分別為色譜柱，進樣器，連續(xù)管和流通池對W的貢獻(min)

Wlc，Wfc：(式2.12)

X，X1，：無特征結(jié)構(gòu)的溶質(zhì)(圖7.8，7.17和7.19)

X2，X3

XB：流動相中的B溶劑的摩爾分數(shù)

V：折合速度，等于udp/Dm(式2.11)

б：高斯曲線的標準偏差;等于峰底的1/4

ι：檢測器響應(yīng)時間常數(shù)(S)

φ：流動相中B溶劑的體積分數(shù);等于0.0

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